本作は、22世紀の銀河を舞台に、連合軍のシェパード少佐率いる精鋭部隊とともに、銀河の法と秩序を守る組織「スペクター」の一員でありながら全銀河を脅威にさらす陰謀を秘めた人物・サレンの脅威の決定的な証拠を掴むために冒険を繰り広げていく。
シェパードは、静穏なはずの宇宙が絶望的な終末を迎えつつあり、阻止できるのは自分たちだけであることを知り、やがて、すべての種族の未来と、銀河系における人類への評価を左右する重大な決断を迫られることになる。
本作では、ゲーム開始時に性別や容姿のほか、生い立ちや経歴といった主人公のバックグラウンド、戦闘のスタイルを決めるクラスを選択する。そして、バックグラウンドの選択によってNPCの反応やサブクエストが変化する。また、装備する武器、防具によってもキャラクタの外見は変化する。
さらに、すべての会話シーンで、プレイヤーはシェパードの言動を選択できる。この会話選択により、目的のためには手段を選ばない冷徹なエージェントとなる、優しさと厳しさを兼ね備えた英雄的な人物となる、など、シェパードのキャラクタ性とストーリーも変化する。
戦闘パートは、敵との遭遇がにシームレスで開始され、リアルタイムに進行する。攻撃方法には、遠近距離武器と機械生命体の行動を乱す「テクノロジー」、敵に大きなダメージを与える「バイオティックパワー」の3種類があり、キャラクタのクラスや戦況、敵の種類に合わせて使い分けが行える。
また、部隊へ命令を下し、戦術的にバトルを進めることもできる。
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